Questões de Biologia do ano 2004

Primers são pequenos fragmentos com cerca de 20 pares de bases complementares a cada uma das extremidades do fragmento de DNA de interesse e que produzem uma terminação 3' –OH livre, necessária para a polimerase iniciar a síntese do DNA.

A mistura submetida à PCR é resfriada até 55°C ou 65°C após um aquecimento a 95°C para permitir a desnaturação do DNA por DNAses específicas.

Uma enzima especial resistente ao calor chamada Taq DNA polimerase promove a separação da dupla fita de DNA a 95°C.

Ocorre uma variação cíclica da temperatura durante todo o processo, sendo que, a cada ciclo, a quantidade de DNA aumenta em progressão aritmética e o número de ciclos não pode ultrapassar um período de 24 horas.

O resultado do exame independe do número de fragmentos de DNA com tandem repeat analisado, uma vez que a seqüência é invariável dentro de uma mesma molécula de DNA.

As seqüências de repetição ou VNTRs (do inglês Variable Number of Tandem Repeat) são utilizadas em testes de paternidade por DNA por serem altamente conservadas, permitindo estabelecer semelhanças com seqüências relacionadas.

A única maneira de se estabelecer paternidade é através da técnica de hibridização.

As seqüências de repetição ou VNTRs (do inglês Variable Number of Tandem Repeat) são utilizadas em testes de paternidade por DNA por serem altamente polimórficas.

Na eletroforese em gel de poliacrilamida é possível separar grandes fragmentos de DNA bacteriano com mais de 10.000 kb variando-se a consistência do gel e a voltagem da corrente elétrica.

Ainda não é possível separar fragmentos de DNA com mais de 10.000 kb por eletroforese em gel, sendo necessária ação de enzimas para a produzir um grande número de pequenos pedaços, o que torna o processo muito trabalhoso.

Na eletroforese de campo pulsátil (PFGE – Pulsed field gel electrophorese), um número menor de fragmentos maiores de DNA podem ser separados em discretas bandas em gel de agarose porque a corrente elétrica muda de direção em intervalos de tempo e ângulos pré-determinados.

Não é possível estabelecer genótipos em gel de agarose ou de poliacrilamida. Para tanto são utilizadas técnicas como Southern blot e Northern blot.

Em condições de estringência severas, com altas temperaturas, ou com baixa concentração de sais, não ocorre pareamento de bases, mesmo que as seqüências sejam perfeitamente complementares.

Para que ocorra hibridização, ou pareamento, as sondas utilizadas devem ser perfeitamente complementares, independentemente do grau de estringência utilizados.

Na hibridização de colônias de bactérias, em meio de cultura sólido, as bactérias são tratadas com álcali por 5 minutos. Em seguida, acrescenta-se à superfície do meio, as sondas marcadas com radioativaidade e incuba-se para que haja hibridização.

O relaxamento nas condições de estringência pode levar a imperfeições no pareamento entre as fitas. Embora haja perda da especificidade, esse procedimento permite detectar seqüências parcialmente similares.

A principal diferença entre as técnicas Southern blot e Northern blot, é que a primeira utiliza gel de poliacrilamida e, a segunda, gel de agarose.

Depois de separadas por eletroforese, em gel de poliacrilamida, as bandas são cuidadosamente cortadas e transferidas para uma membrana de nitrocelulose, onde são hibridizadas com sondas específicas e coradas com brometo de etídio para serem visualizadas sob UV.

Fragmentos de DNA são separados por eletroforese em gel de agarose e tratados com o intercalante brometo de etídio, podendo, assim, serem visualisados sob luz ultravioleta antes de serem hibridizados em papel de nitrocelulose.

A técnica de Southern blot não é sensível o suficiente para detectar polimorfismos que determinam alterações de clivagem, quando as alterações são muito pequenas.